pTrc-DzCMK plasmid vector原核表达质粒载体 BioVector NTCC质粒载体菌种细胞基因保藏中心

pTrc-DzCMK plasmid vector原核表达质粒载体

薯蓣皂苷元(又称皂素)是合成众多甾体类药物的重要中间体。盾叶薯蓣的根状茎富含皂素,是我国皂素生产的主要原料。迄今为止,皂素的生物合成途径还没有被完全阐明,人们普遍认为细胞质甲羟戊酸(MVA)途径所形成的异戊二烯焦磷酸(IPP)及其异构体二甲基丙烯基焦磷酸(DMAPP)是皂素合成的重要前体物质。众所周知,在高等植物的质体中也存在着一条合成IPP和DMAPP的2-甲基-D-赤藓糖醇-4-磷酸(MEP)途径。有报道表明,在一些植物中MEP和MVA途径所合成的IPP和DMAPP存在交流,但在盾叶薯蓣中这种交流是否存在、MEP途径是否参与皂素生物合成等问题尚未见报道。为了今后探讨这些问题,本研究利用RT-PCR和RACE等技术克隆得到了盾叶薯蓣MEP途径的4-胞苷5-磷酸-2-C-甲基-D-赤藓糖醇激酶(CMK,MEP途径的第四个酶)和4-羟基-3甲基-2赤藓磷酸合酶(HDS,MEP途径的第六个酶)的cDNA基因,并验证了它们功能。主要研究结果如下:1、盾叶薯蓣CMK的cDNA基因(命名为DzCMK)全长1303 bp,包含一个1170 bp的开放阅读框,60 bp的5’非翻译区(5’untranslational region,5’UTR)和73 bp的3’非翻译区(3’untranslational region,3’UTR)。DzCMK编码一个由389个氨基酸残基组成的蛋白(DzCMK)。该蛋白的预测分子量为42.99 KD、等电点为6.77;其氨基酸序列与其它植物的CMK的一致性比较高,与巴西橡胶树CMK的一致性高达82%;具有CMK蛋白三个典型的结合域,Motif A、Motif B和Motif C,并在N末端有一个有44氨基酸残基组成的质体信号肽。2、盾叶薯蓣HDS的cDNA基因(命名为Dz HDS)全长2488 bp,包含一个2250 bp的开放阅读框,60 bp的5’UTR和178 bp的3’UTR。DzHDS编码一个由749个氨基酸残基组成的蛋白(DzHDS)。该蛋白的理论分子量为82.7 KD、等电点为6.08,在N末端有一个有43氨基酸残基组成的质体信号肽,其氨基酸序列与其它植物HDS也有比较高的一致性,其中与菠萝的一致性最高(88%)。3、分别构建了DzCMK和DzHDS大肠杆菌表达载体pTrc-DzCMK和pTrc-DzHDS,并将它们分别与pAC-BETA质粒共转化大肠杆菌。结果发现,含pTrc-DzCMK与pAC-BETA双质粒的菌落和含pTrc-DzHDS与pAC-BETA双质粒的菌落的黄色比含pAC-BETA与p Trc双质粒菌落颜色明显要深,表明DzCMK基因和DzHDS基因在大肠杆菌的表达增强了大肠杆菌β-胡萝卜素的合成,证明DzCMK和DzHDS是MEP途径中有功能的基因。4、分别把DzCMK和DzHDS基因信号肽编码序列(CMKP和HDSP)与绿色荧光蛋白(GFP)基因一起构建融合基因,CMKP-GFP和HDSP-GFP,并分别将它们克隆到植物双元表达载体pCAMBIA2×35S-Tnos中,得到pCAMBIA2×35S-CMKP-GFP-Tnos和pCAMBIA2×35S-HDSP-GFP-Tnos两个植物表达载体。将这两个载体分别导入根癌农杆菌后,利用农杆菌介导法转化烟草,并获得转基因再生植株。制备转基因烟草叶片原生质体,通过激光共聚焦显微镜观察发现,CMKP-GFP融合蛋白和HDSP-GFP融合蛋白都定位在叶绿体中,这与DzCMK和DzHDS是质体MEP代谢途径的酶相吻合。

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