pET28a-6xHis-Biotin-EGFP生物素标记原核表达载体荧光标签His标签-BioVector NTCC质粒载体菌种细胞基因保藏中心

pET28a-6xHis-Biotin-EGFP plasmid

描述：

pET28a-6xHis-Biotin-EGFP生物素标记原核表达载体荧光标签His标签。生物素可以与亲和素、链霉亲和素非常紧密地结合，因而，生物素标记蛋白广泛应用于免疫学、细胞生物学和分子生物学的实验研究领域，以及作为亲和分离制剂，用于相应配基的分离与纯化。AviTag是15 个氨基酸的短肽，具有单生物素化赖氨酸位点。

生物素可以与亲和素、链霉亲和素非常紧密地结合，因而，生物素标记蛋白广泛应用于免疫学、细胞生物学和分子生物学的实验研究领域，以及作为亲和分离制剂，用于相应配基的分离与纯化。传统的生物素标记方法通常利用生物素的羧基加以化学修饰可制成各种活性基团的衍生物，活化生物素可以与各种生物大分子结合，用于标记各种蛋白质(包括抗体、葡萄球菌A蛋白、酶、激素等)、多肽、多糖、核酸及核素、荧光素、胶体金等。由于反应条件比较剧烈，化学方法生物素化过程中，一些相对敏感的蛋白容易失活；同时，由于活化的生物素不具有识别特定蛋白质的能力，因而化学方法生物素化是非特异的。 生物素连接酶 (Biotin Ligase)能活化生物素形成生物素酰 -5'-腺苷酸，将生物素特异地转移到生物素受体蛋白－AviTag上，使蛋白生物素化。AviTag是15 个氨基酸的短肽，具有一个单生物素化赖氨酸位点，与已知天然可生物素化序列完全不同，可以加在目标蛋白的N端和C端，融合表达后，在体内或体外均可被生物素连接酶生物素化。

与化学生物素标记法相比，生物素AviTag标签系统具有以下几大优点： 无论在体外或者体内，几乎所有的蛋白都可以在一个独特的AviTag位点轻易且有效地被生物素化； 由于此类生物素化是通过酶和底物的反应来实现，反应条件相当温和而且标记的专一性极高； 每一个AviTag仅可以加入一个生物素分子，对整个蛋白的活性和功能影响很小。

Biotin ligase催化的生物素化应用实例：

（选取数个基因，表达载体为WG05，同时含有6×His Tag、Sumo与AviTag）

图二、通过AviTag进行生物素化的重组蛋白示意图

通过Biotin Ligase生物素化的重组蛋白的检测：

图三、通过Biotin Ligase进行生物素化的重组蛋白的表达及检测

• 考马斯亮蓝染色

• Anti-His Antibody作为一抗进行Western Blotting

• HRP-Streptavidin直接反应检测生物素化的重组蛋白

• 1．Protein ladder

• 2～11．选取10个基因表达产物（经过Biotin Ligase催化生物素化）

• 12．未经生物素化的基因表达产物

• 13．对照，重组β-葡萄糖苷酸酶（His-Gus）

• 14．对照，参与酶促反应的Biotin Ligase

与抗原抗体反应相比，生物素化的检测灵敏度更高：

图四、通过Biotin Ligase生物素化的重组蛋白进行不同方法检测

• 丽春红染色

• Western Blotting，DAB显色
  1,8,9．Protein ladder
  2,10．对照，重组β-葡萄糖苷酸酶（His-Gus）
  3～7,11～15．不同浓度的重组蛋白