BioVector® 布氏瘤胃球菌 (Ruminococcus bromii) 菌株

一 产品基本信息与微生物学背景

• 学名：Ruminococcus bromii（布氏瘤胃球菌）。

• 分类学地位：厚壁菌门（Firmicutes）、梭菌纲（Clustridia）、梭菌目（Clostridiales）、瘤胃球菌科（Ruminococcaceae）、瘤胃球菌属（Ruminococcus）。

• 形态与生理特征：

  • 细胞形态：革兰氏染色阳性（在老龄培养物中可能呈革兰氏阴性或可变），细胞呈球状或卵圆形，常成对或排列成短链状，不具运动性，不产芽孢。

  • 代谢类型：严格厌氧（Strictly anaerobic）。

  • 核心底物特异性（标杆碳源转化者）：布氏瘤胃球菌是哺乳动物肠道及反刍动物瘤胃中最重要的抗性淀粉（Resistant Starch, RS）降解核心驱动菌。它具有极为狭窄但高度特异性的碳源利用谱，无法利用常规的游离葡萄糖或果糖，但对高分子量、结晶度高的抗性淀粉具有极强的黏附和解聚能力。

二 核心科研价值与肠道微生态代谢降解机制

在人及动物肠道宏基因组和代谢组学研究中，布氏瘤胃球菌被公认为“基石物种（Keystone Species）”。其核心代谢价值通过以下精细的降解网络展现：

1. 独特的“淀粉降解体（Amylose-degrading complex / Amylosome）”结构：

   与大多数释放可溶性淀粉酶的细菌不同，布氏瘤胃球菌的表面拥有一组复杂的、类似于纤维素体的多酶复合体（淀粉降解体）。该复合体通过特异性的黏附素（Adhesins）将菌体直接紧密锚定在抗性淀粉颗粒表面，随后协同启动多种外源和内源淀粉酶、拉兰酶（Pullulanases），将顽固的结晶淀粉直接原位解聚为短链寡糖（如麦芽糖、麦芽三糖）。

2. 跨物种代谢共生（Cross-feeding）协作网络：

   布氏瘤胃球菌主要将淀粉转化为乙酸、乙醇、甲酸以及氢气（$H_2$）和二氧化碳（$CO_2$），它本身不产生或极少产生丁酸。然而，它解聚出来的外源游离寡糖以及释放的乙酸，是肠道内其他核心益生菌（如普拉丝网菌 Faecalibacterium prausnitzii、直肠真杆菌 Eubacterium rectale 等丁酸产生菌）必不可少的营养源。

   没有布氏瘤胃球菌对抗性淀粉的一级“破壁开凿”，下游的丁酸菌就无法有效利用这些膳食纤维，因此它直接决定了宿主肠道内短链脂肪酸（SCFAs，尤其是丁酸）的最终丰度。

3. 代谢综合征与肥胖控制研究：

   临床研究表明，高膳食纤维（抗性淀粉）饮食能否有效降低宿主体重、改善胰岛素抵抗（改善 2 型糖尿病），高度依赖于受试者肠道内是否存在足够数量的布氏瘤胃球菌。它是评估膳食精准干预（Nutritional Intervention）药效的重要微生态功能指示菌。

三 实验室严格厌氧培养、传代与冻存标准步骤

1. 专用培养基配方与环境参数

布氏瘤胃球菌对氧气极度敏感，微量的氧气暴露即可导致菌体迅速死亡，必须在严格的厌氧工作站（Anaerobic Workstation，含 $80\%\ N_2 + 10\%\ CO_2 + 10\%\ H_2$ 混合气体）中操作。

• 推荐基础培养基：

  • YCFA 培养基（Yeast Casitone Fatty Acid Medium，最推荐，能够完美模拟肠道挥发性脂肪酸环境）。

  • 改进型 PYG 培养基（Peptone Yeast Glucose Medium，需将基础葡萄糖替换为 1% 可溶性淀粉或玉米抗性淀粉）。

• 完全培养基关键添加配方（每升）：

  • 胰蛋白肽 / 酪蛋白胨：10.0 g

  • 酵母提取物：2.5 g

  • 碳源（核心控制）：可溶性淀粉或抗性淀粉 10.0 g（禁止单独使用高浓度葡萄糖）

  • 挥发性脂肪酸混合液（含乙酸、丙酸、丁酸、异戊酸等）：共约 3.1 mL（YCFA 标准配比）

  • 血红素（Hemin）溶液：1.0 mL

  • 间 resettlement 硫胺素 / 维生素混合液：1.0 mL

  • 厌氧氧化还原指示剂：刃天青（Resazurin，1 mg/L，培养基除氧完全后由粉红色变为无色透明）

  • 还原剂（除氧剂）：L-半胱氨酸盐酸盐（L-Cysteine HCl） 0.5 g 或者是 硫化钠（$Na_2S$） 0.25 g

• 培养物理参数：标准 37 摄氏度，绝对无氧。

2. 冻存菌种的厌氧复苏流线

1. 提前 24 小时在厌氧工作站中制备好厌氧 YCFA 液体试管或固体平板，使其充分还原（刃天青彻底褪色为无色）。

2. 从液氮罐或 -80 ℃ 冰箱中取出布氏瘤胃球菌冻存管。

3. 快速复苏（关键防氧保护）：保持管盖锁死，立刻投入 37 ℃ 水浴箱中剧烈摇动，在 1 分钟内使其急速融化。

4. 迅速用酒精擦拭管壁，立刻将其移入厌氧工作站内部。

5. 在厌氧环境下拧开管盖，用一次性无菌无氧移液管吸取全部菌悬液，注入盛有 5 - 10 mL 预热 YCFA 液体培养基的厌氧试管（或 Hungate 厌氧管）中。

6. 盖紧管塞，置于 37 ℃ 恒温孵箱中静置培养 24 - 48 小时，动态观察培养基是否变浑浊。

3. 日常常规传代与生长质检规范

• 传代时机：布氏瘤胃球菌生长相对较为缓慢。当液体培养基由澄清变为轻微至中度浑浊（$OD_{600}$ 达到 0.5 - 0.8 左右，通常在接种后 24 - 36 小时）时，应立即进行传代。切勿让其过度老熟（培养超过 72 小时），否则菌体会发生自溶或由于代谢产物（如乙酸）积聚而迅速失去生活力。

• 操作传代步骤：

  1. 在厌氧工作站内，吸取处于对数生长旺盛期的菌液，按 5% - 10% 的高比例 免疫接种至新鲜的、已完全还原的 YCFA 液体培养基或铺布于 YCFA 固体平板上。

  2. 若使用平板培养，接种后应将平板置于含催化剂的厌氧产气袋或厌氧缸中，再移出工作站放入 37 ℃ 孵箱（若工作站自带孵箱则直接放置）。

  3. 传代周期通常为每 2 天一次。

4. 模型稳定性与防止退化质检

1. 纯度检查与防范杂菌污染：由于厌氧培养基极度营养丰富，且操作都在工作站内，极易受到其他生长更快的厌氧菌（如大肠杆菌变异株或拟杆菌）的交叉污染。每传代 5 次，必须将菌液涂布于 YCFA 固体平板上进行单克隆分离，观察克隆形态是否呈现规整、细小、白至略带透明的圆形凸起菌落。

2. 形态学与基因组双重确证：定期进行革兰氏染色显微镜观察（确认无杂菌球菌或杆菌），并提取全基因组 DNA 进行 16S rRNA 基因全长测序鉴定，确保其与 Ruminococcus bromii 的同源性 $\gt 99\%$。

5. 菌种长期保存标准

布氏瘤胃球菌不产芽孢且对氧极度敏感，常规冷冻极易导致绝大部分菌体死亡。必须严格执行以下高保护性冻存程序：

• 厌氧冻存液配方：70% 完全还原的 YCFA 液体培养基 + 30% 灭菌纯甘油（混合后甘油终浓度为 15% v/v）；或者使用专用的厌氧菌冻存保护剂。该冻存液在配制时必须提前加入 L-半胱氨酸盐酸盐并在厌氧站内通氮除氧，确保刃天青呈无色状态。

• 冷冻保存规范：

  1. 收集培养了 24 小时左右、处于对数生长中后期的浓稠布氏瘤胃球菌菌液。

  2. 在厌氧工作站内，将菌液与预冷的厌氧冻存液按 1:1 的体积比例 充分混合混匀。

  3. 分装入带橡胶垫圈的无菌耐压冻存管中，严格拧紧拧死。

  4. 将冻存管移出厌氧站，立刻投入程序降温盒中，置于 -80 ℃ 冰箱中梯度降温过夜。

  5. 24 小时内，迅速将冻存管转移并永久沉入液氮罐（-196 ℃）中实施封存。

  6. 质控警告：禁止在 -80 ℃ 普通超低冰箱中进行超过 3 个月的长期搁置，微量的温度波动会导致该菌的复苏存活率大幅衰减。

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