ATCC® 19718™ 欧洲亚硝化单胞菌——产品技术说明书 (Product Datasheet)

1. 产品基本信息与鉴定谱系 (Product & Identification General Information)

• 菌株学名：Nitrosomonas europaea Winogradsky

• ATCC 编号：19718™

• 生物学分类：细菌域 (Bacteria) $\rightarrow$ 变形菌门 (Proteobacteria) $\rightarrow$$\beta$-变形菌纲 (Betaproteobacteria) $\rightarrow$ 亚硝化单胞菌目 (Nitrosomonadales) $\rightarrow$ 亚硝化单胞菌属 (Nitrosomonas)

• 生理代谢特性：专性化学自养菌 (Obligate chemolithoautotroph)。该菌无法利用有机碳源，其生长所需的全部能量与还原力均通过将氨（$NH_4^+$）氧化为亚硝酸盐（$NO_2^-$）来获得。

• 主要应用与特征：

  • 模式生物：用于氨氧化生物动力学、肥效流失及硝化抑制剂（如 Cd(II)、双氰胺）的研究。

  • 高效产酶：该菌株天然高效表达羟氨氧化还原酶 (Hydroxylamine oxidoreductase) 和 氨单加氧酶 (Ammonia monooxygenase)。

  • 单细胞蛋白：具备用于食品或饲料生产单细胞蛋白的潜在应用价值。

2. 基因组架构特征 (Genome Architecture)

• 基因组状态：已完成全基因组测序（Reference Genome）。

• 染色体结构：单链环状 DNA（Single circular chromosome）。

• 基因组大小：约 2,812,094 bp。

• 编码基因数：包含约 2,462 个蛋白质编码基因及 48 个 RNA 基因。

• NCBI 登录号/GenBank：AL954747；Taxonomy ID：228410。

3. 标准培养基配方 (Culturing Medium & Formulation)

由于 Nitrosomonas europaea 是极为严格的自养菌，培养基中严禁含有高浓度的有机物（如蛋白胨、酵母粉等），否则会强烈抑制其生长。同时，该菌株对玻璃器皿表面的杂质极其敏感，所有使用的器皿必须经过深度酸洗与去离子水彻底冲洗。

专用培养基：ATCC Medium #2265: Nitrosomonas Medium

• 基础无机盐配方：

  • $(NH_4)_2SO_4$ （氨源/能量底物）：3.0 g

  • $K_2HPO_4$ ：0.5 g

  • $MgSO_4 \cdot 7H_2O$ ：0.05 g

  • $CaCl_2 \cdot 2H_2O$ ：0.004 g

  • $FeSO_4 \cdot 7H_2O$ （或螯合铁）：0.005 g

  • 去离子水：1.0 L

• pH 调节与缓冲体系：使用无菌的 $Na_2CO_3$ 或 $CaCO_3$ 溶液将培养基初始 pH 调节至 7.5 – 8.0 之间（碳酸盐同时作为其生长的唯一无机碳源）。

• 光敏感特性与红线 (Light Sensitivity Warning)：

  • ATCC #2265 培养基具有高度的光敏感性。在光照下暴露会迅速降解并产生有毒的自由基副产物，导致液体培养基在约 3 个月后失效。

  • 操作红线：配制好的培养基必须全程使用铝箔纸严密包裹以阻绝光照。超过 3 个月的培养基即使未开封也应废弃并重新配制，以确保菌株存活率。

4. 物理环境与控制参数 (Controlled Culture Conditions)

• 孵育温度：26.0 ℃（标准中温孵育，不可放置于 37 ℃ 避光培养箱中）。

• 气相与通气性能：

  • 液体震荡培养：推荐使用三角锥瓶（Erlenmeyer flask）或透气细胞培养瓶。

  • 摇床转速：在旋转式摇床中以 200 rpm 恒速震荡，以提供充足的溶解氧（氨氧化过程消耗大量氧气）。

• 光照控制：必须全程在绝对黑暗中（In the dark）进行孵育。培养瓶外部必须包裹铝箔纸。

• 生长周期与表征：自养菌生长缓慢，通常在接种后 3 至 5 天 才会观察到明显的菌体生长。生长表征为培养液呈现轻微的浑浊（Cloudy turbidity），或通过化学试剂检测到亚硝酸盐（Nitrite test）强阳性。

5. 传代操作与菌种维持 (Subculturing Protocol)

• 传代周期：每 1 至 3 周 必须传代一次。

• 推荐接种量 (Inoculum Ratio)：建议采用 10% 的大接种量（即每 100 mL 新鲜培养基中加入 10 mL 处于对数生长期的成熟菌液）。

• 短期维持短期保存：完全长好的成熟菌液可置于 4 ℃ 冰箱中避光暂存。

6. 复苏流程 (Thawing & Recovery Workflow)

1. 准备一瓶装有 10 mL 无菌 ATCC #2265 液体培养基的三角锥瓶，并提前用铝箔纸包裹避光。

2. 从超低温冷冻储存环境中取出 ATCC 19718 的冻存管。

3. 快速复苏（快融原则）：立刻将冻存管浸入 37 ℃ 水浴箱 中，轻微摇晃使其在 60–90 秒内 迅速融化（切勿让水没过管盖以防污染）。

4. 在无菌超净台内，用酒精消杀管壁，将冻存管内的全部菌体悬液无菌转移（Aseptically transfer） 至准备好的 10 mL 避光培养基中。

5. 盖好瓶盖，置于 26 ℃、200 rpm 的暗色震荡摇床中培养，严密观察 3–5 天直至液体变浑浊。

7. 生物安全、长期保存与质控标准 (Biosafety & Storage)

• 生物安全等级 (BSL)：BSL-1。该菌株对健康成年人、动物及环境无致病性，属于低风险基础实验室操作菌株。

• 长期保存参数：

  • 甘油冷冻：可使用保护剂置于 -80 ℃ 或更低温度 的超低温冰箱中长期冷冻。

  • 液氮冻存：置于液氮（-196 ℃）气相中可实现永久休眠储存。

ATCC® 19718™ Nitrosomonas europaea Winogradsky Product Datasheet

1. Product & Identification General Information

• Scientific Name: Nitrosomonas europaea Winogradsky

• ATCC Number: 19718™

• Taxonomy Lineage: Domain Bacteria $\rightarrow$ Phylum Proteobacteria $\rightarrow$ Class Betaproteobacteria $\rightarrow$ Order Nitrosomonadales $\rightarrow$ Family Nitrosomonadaceae $\rightarrow$ Genus Nitrosomonas

• Physiological State: Obligate chemolithoautotroph. It derives all its energy and reductant for growth strictly from the oxidation of ammonia ($NH_4^+$) to nitrite ($NO_2^-$).

• Specific Applications: Used as a reference model organism for ammonia oxidation biokinetics; bioinformatics; highly produces hydroxylamine oxidoreductase and ammonia monooxygenase; potential strain for single-cell protein production.

2. Genomic Features

• Status: Whole-genome sequenced reference strain.

• Chromosome: Single circular chromosome of 2,812,094 bp.

• Gene Statistics: ~2,462 protein-coding genes; 48 RNA genes.

• NCBI Accession / GenBank ID: AL954747; Taxonomy ID: 228410.

3. Culture Medium Formulation: ATCC Medium #2265

• Inorganic Salts Mix:

  • $(NH_4)_2SO_4$ : 3.0 g

  • $K_2HPO_4$ : 0.5 g

  • $MgSO_4 \cdot 7H_2O$ : 0.05 g

  • $CaCl_2 \cdot 2H_2O$ : 0.004 g

  • $FeSO_4 \cdot 7H_2O$ : 0.005 g

  • Distilled/Deionized Water: 1.0 L

• pH & Buffer System: Adjust initial pH to 7.5 – 8.0 using sterile $Na_2CO_3$ or $CaCO_3$ solution (serves as the sole inorganic carbon source).

• Light Sensitivity Warning: ATCC Medium #2265 is highly light-sensitive and degrades after prolonged exposure to light (~3 months). Crucial Operational Step: Always cover the media and culture vessels completely in aluminum foil to extend shelf life and prevent toxic radical formation.

4. Controlled Environmental Conditions

• Incubation Temperature: 26.0 °C (Do not incubate at 37 °C).

• Aeration & Gas Composition: Cultured in Erlenmeyer flasks in a shaking incubator at approximately 200 rpm to guarantee high oxygen availability.

• Illumination: Must be incubated in the absolute dark (cover culture flasks tightly with foil).

• Growth Metrics: Autotrophic growth is slow; visual turbidity or a positive nitrite test should be evident within 3 to 5 days.

• Glassware Warning: This strain is highly sensitive to trace chemical residues or impurities on glassware; utilize deep acid-washed vessels.

5. Subculturing Protocol & Maintenance

• Passaging Interval: Transfer the culture every 1 to 3 weeks.

• Recommended Inoculum: A 10% inoculum volume (e.g., 10 mL of active log-phase culture per 100 mL of fresh medium) is highly recommended.

• Short-Term Storage: Fully grown cultures can be temporarily stored at 4 °C in the dark.

6. Thawing & Recovery Workflow

1. Pre-dispense 10 mL of sterile ATCC Medium #2265 into an Erlenmeyer flask and wrap it securely with aluminum foil.

2. Retrieve the frozen ATCC 19718 vial from ultra-low temperature storage.

3. Thaw the frozen vial rapidly by immersing it in a 37 °C water bath with gentle swirling until the ice completely melts (60–90 seconds).

4. Sanitize the vial with alcohol, then aseptically transfer the entire contents of the vial into the 10 mL pre-wrapped medium.

5. Incubate the flask in a dark shaking incubator at 26 °C and 200 rpm for 3–5 days until a cloudy turbidity develops.

7. Biosafety, Storage & Quality Standards

• Biosafety Level: BSL-1. Low risk to human health or laboratory safety.

• Long-Term Storage: Cryovials must be maintained at -80 °C or colder (or within liquid nitrogen vapor phase) for optimized structural and genetic preservation.

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