BioVector® HD10.6 条件永生化人类感觉神经元细胞株——产品技术说明书

1 产品基本信息与遗传背景

• 产品名称：HD10.6 条件永生化人类感觉神经元细胞株

• 常用别名：HD10.6，Human DRG Cell Line 10.6

• 生物学来源：人类 Homo sapiens（男性，胎龄 < 12周）

• 组织器官定位：外周神经系统 / 背根神经节（Dorsal Root Ganglion, DRG）

• 生长特性：

  • 增殖期（未分化）：贴壁生长，呈成纤维细胞样或多边形前体细胞形态。

  • 分化期（成熟后）：停止分裂，伸展出长而复杂的神经突触，形成典型的感觉神经元网络。

• 永生化工程机制：细胞通过转导整合了受四环素/多西环素控制的调控型 v-Myc 癌基因（Tetracycline-regulated v-Myc oncogene）。

• 核心科研价值：HD10.6 是目前极少数可实现体外大规模扩增的人类源性感觉神经元模型。它克服了动物（大鼠/小鼠）DRG 神经元与人类在伤害感受通路上的种属差异，广泛应用于：

  1. 人类慢性疼痛、神经病理性疼痛与外周敏化机制的研究。

  2. 新型镇痛药物、阿片受体激动剂以及靶向离子通道抑制剂的体外筛选。

  3. 单纯疱疹病毒1型（HSV-1）在人类神经元中建立终身隐性潜伏与激活的分子动力学模拟。

  4. 由 SARM1 介导的轴突退行性病变（Axon Degeneration）与神经损伤修复模型。

2 细胞生物学特征与核心标志物表型

HD10.6 具有典型的“双向开关”生物学行为，通过化学诱导可在增殖状态与成熟感觉神经元状态之间进行精确切换：

未分化增殖状态（Naive 状态）

细胞表现出活跃的有丝分裂（倍增时间约为 1.2 天）。在没有多西环素（Doxycycline）的培养体系下，v-Myc 强效表达，维持细胞的不死性。

诱导分化成熟状态（Mature 状态）

加入多西环素后，v-Myc 癌基因的转录被强行关闭（Tet-Off 模式），细胞彻底退出细胞周期并启动神经元专项分化。其标志物谱系会发生剧烈重塑：

• 神经干性与神经营养因子受体：稳定上皮及功能性表达神经营养蛋白受体家族 TrkA、TrkB、TrkC 以及 RET。

• 特征性结构蛋白：高表达外周神经特异性中间丝蛋白——外周蛋白（Peripherin），以及神经丝蛋白（Neurofilament）。

• 伤害性感受器与 neuropeptides（ neuropeptides）：伴随分化时间的延长（通常诱导 21-28 天），细胞强阳性表达疼痛相关核心离子通道 TRPV1、Nav1.7、Nav1.8 以及经典神经肽 CGRP（降钙素基因相关肽）和 Substance P（P物质）。

• 电生理特征：分化后的成熟神经元在全细胞膜片钳（Whole-cell patch clamp）下可记录到重复的动作电位发放，并展现出外周伤害感受器特有的 TTX 耐受性（河豚毒素耐受性）钠电流。

3 专用两阶段培养基配方规范

红线警告：培养 HD10.6 必须严格区分“增殖期”与“分化期”两种完全不同的培养基配方。若在扩增阶段错误加入多西环素，将导致细胞过早停止分裂并引发大规模凋亡。

A 阶段：增殖期完全生长培养基（用于常规细胞扩增与维持）

• 基础培养基：DMEM/F12（1:1 复合培养基）。

• 血清添加：10% 优质胎牛血清（FBS，建议进行热灭活处理）。

• 基因筛选维持抗生素：加入 200 ug/mL 的 G418（Geneticin），用于维持 Tn5 neo 永生化筛选压（可选，视具体克隆质控而定）。

• 双抗补剂：1% 青霉素-链霉素溶液。

• 此阶段绝对禁止添加多西环素。

B 阶段：专性神经分化培养基（用于实验前伤害感受器功能诱导）

• 基础骨架：Neurobasal 培养基（或无血清减毒 DMEM/F12）。

• 核心功能组件：2% B-27 Supplement（50X 标准型）。

• 基因关闭剂（核心红线）：加入 多西环素（Doxycycline），终浓度为 1.0 到 2.0 ug/mL（用以完全阻断 v-Myc 的表达，促使细胞分化）。

• 神经营养因子联合鸡尾酒（分化必需）：

  • 人类重组神经生长因子（Recombinant Human NGF）：终浓度 50 ng/mL。

  • 胶质细胞源性神经营养因子（GDNF）：终浓度 20 ng/mL。

  • 脑源性神经营养因子（BDNF）：终浓度 20 ng/mL。

4 物理环境与贴壁包被控制参数

• 孵育温度：37.0 ℃（温控误差应控制在正负 0.3 ℃ 以内）。

• 气相环境：5% 二氧化碳（CO2），加湿平衡空气。

• 基质包被规范（关键点）：

  • 增殖期：细胞可直接贴壁于普通经过组织培养处理（TC-treated）的塑料瓶/皿中。

  • 分化期：由于分化后的神经元胞体极易悬浮脱落，在启动分化前，必须提前使用 Poly-L-Lysine（聚左旋赖氨酸，PLL，0.01%）合并 聚鸟氨酸（Poly-L-ornithine）与层粘连蛋白（Laminin）对孔板或爬片进行双重包被，以赋予生长突触足够的锚定力。

5 细胞传代与长周期分化操作规范

增殖期常规传代操作（未分化状态）

• 传代临界点：当细胞密度达到 80% 至 85% 汇合度时必须传代。切勿让细胞全盘长满，否则细胞会自发启动接触抑制并导致后续的分化潜能出现不可逆衰退。

• 建议传代稀释比例：1:3 到 1:4（常规每 3 天传代一次）。

1. 吸去旧培养基，使用不含钙镁离子的无菌 PBS 轻轻洗涤细胞表面 1-2 次。

2. 加入适量预热的 0.05% Trypsin-EDTA（温和胰酶），在 37 ℃ 孵箱中消化 1-2 分钟。

3. 镜下观察发现细胞开始变圆、边缘收缩，且轻晃培养瓶见细胞层成片滑落时，立即加入 2 倍体积的含血清增殖期完全培养基终止消化。

4. 用移液枪轻柔吹打瓶壁，收集细胞悬液至 15 mL 离心管中，在 200 x g 下离心 5 分钟。

5. 弃去上清，加入新鲜增殖期培养基重悬，计数后按常规密度接种至新培养瓶。

实验前神经元诱导分化流程（长周期成熟法）

根据 2026 年最新的多轴向多模态技术文献验证，HD10.6 需要经历长周期（长期渐进成熟，DIV 21-28）的成熟过程，其伤害性感受离子通道（如 TRPV1 和 TTX-R 钠通道）才能达到功能性巅峰：

1. 将增殖期的 HD10.6 细胞消化，以较稀的密度（约 $2.0 \times 10^4 \text{ cells/cm}^2$）接种至提前进行过 PLL/Laminin 包被的实验板中。

2. 贴壁 24 小时（待细胞完全展弦）后，彻底抽干增殖期培养基。

3. 更换为全新的 B阶段：专性神经分化培养基（含 Doxycycline、NGF、GDNF、BDNF）。此时记录为分化第 0 天（DIV 0）。

4. 长周期维持机制：每隔 2-3 天进行一次半量换液（吸出一半旧液，补充等量新鲜的分化完全培养基）。切忌全量抽干换液，分化中的神经元对渗透压和局部自分泌因子的流失极度敏感。

5. 在诱导至第 21 天（DIV 21）到第 28 天（DIV 28）时，细胞突触网络发育完全，TRPV1、Nav1.7通道及 $\mu$-阿片受体功能成熟，即可正式用于钙成像、膜片钳电生理或炎性因子刺激（Inflammatory cocktail）等功能学分析。

6 复苏与冻存恢复流线

1. 提前在 T25 培养瓶中注入 5.0 mL 预热的增殖期完全生长培养基，放入孵箱中平衡 pH 值。

2. 从液氮中取出 HD10.6 冻存管，立刻投入 37 ℃ 水浴箱中水平快速摇晃，在 60-90 秒内使其熔化至仅剩最后一丝冰芯。

3. 酒精无菌擦拭后转入超净台，用大口径移液枪将胞悬液缓慢注入盛有 4.0 mL 预热增殖基的离心管中。

4. 200 x g 低速离心 5 分钟，彻底抽干含 DMSO 的上清。

5. 加入 1.5 mL 增殖培养基轻柔弹散重悬，全量接种到准备好的 T25 瓶中。

6. 24 小时后观察贴壁情况并进行全量换液，以清除未贴壁的死细胞碎片。

7 生物安全、长期保存与质控规范

• 生物安全级别：BSL-2（二级生物安全柜操作）。由于该细胞衍生自人类胚胎原代神经组织，且基因组内集成了逆转录病毒/转导源性的 v-Myc 序列，日常实验必须在二级生物安全实验室内开展。所有废弃物需进行 121 ℃ 高压灭菌 30 分钟。

• 超低温长期保存：冻存液配方为 90% 增殖期完全培养基 + 10% 细胞级 DMSO（或使用无血清通用型冻存液）。必须永久保存在液氮（-196 ℃）环境中，绝对禁止长期滞留在 -80 ℃ 冰箱中，否则条件永生化系统的复苏活力会发生断崖式下跌。

• 分化能力定期抽检（质量控制红线）：连续传代超过 15-20 代后，应随机抽取一盘细胞加入多西环素诱导 7 天。如果在显微镜下发现细胞在加入多西环素后依然疯狂分裂、不长突触、不停止生长，则证实该批次细胞的 Tet-Off 调控系统发生基因突变或 v-Myc 逃逸，该代次细胞必须立即作废，重新复苏低代次种子库。

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