pLenti CMV TRE3G Neo GFP-Progerin BioVector® 慢病毒表达质粒 BioVector® pLenti CMV TRE3G Neo GFP-Progerin Lentiviral Vector

BioVector® pLenti CMV TRE3G Neo GFP-Progerin 慢病毒表达质粒

BioVector® pLenti CMV TRE3G Neo GFP-Progerin Lentiviral Vector

1 产品基本信息与转录框架 / Product Identification and Vector Architecture

• 产品名称 (Product Name)：BioVector® pLenti CMV TRE3G Neo GFP-Progerin 慢病毒四环素诱导表达质粒 (BioVector® pLenti CMV TRE3G Neo GFP-Progerin inducible Lentiviral Expression Plasmid)

• 产品类型 (Vector Type)：第三代慢病毒转导表达载体、四环素/多西环素诱导控制载体 (3rd Generation Inducible Lentiviral Expression Vector)

• 克隆复制子与选择标记 (Replication Loci and Selection Markers)：

  • 大肠杆菌复制子 (Bacterial Ori)：pUC ori（高拷贝复制子 / High-copy replication origin）

  • 大肠杆菌抗性 (Bacterial Resistance)：Ampicillin（Amp 氨苄青霉素抗性，100 ug/mL）

  • 哺乳动物细胞筛选标记 (Mammalian Selection Marker)：Neomycin / G418（新霉素/G418抗性，由独立启动子驱动 / Driven by an independent promoter）

• 核心转录盒配置 (Core Transcriptional Cassette Topology)：

  • 诱导型启动子 (Inducible Promoter)：TRE3G 启动子（第三代四环素响应元件 Tet-Responsive Element，由 7 个重复的 tet 操纵子序列融合一个修饰过的微型 CMV 启动子组成）。该启动子本身处于完全静息状态，几乎没有任何基底漏表达（Basal leakage），只有当细胞内同时表达的 Tet-On 3G 反式激活蛋白与多西环素（Doxycycline / Dox）结合后，才能强力特异性激活下游基因转录。(TRE3G promoter, featuring 7 tandem tet operator repeats bound to a modified minimal CMV window. It exhibits minimal basal leakage and yields robust transcriptional induction only when the Tet-On 3G transactivator binds Doxycycline.)

  • 融合目的基因 (Target Fusion Gene)：GFP-Progerin。绿色荧光蛋白（GFP）的开放阅读框与人类 Progerin（早衰蛋白） 基因的 N 端无缝融合，转录后表达带有绿色荧光定位的早衰蛋白。(The open reading frame of Green Fluorescent Protein is fused directly to the N-terminus of human Progerin, generating a fluorescently trackable mutant lamin A variant.)

2 分子细胞生物学特征与疾病模型价值 / Molecular Dynamics and Disease Modeling

BioVector® pLenti CMV TRE3G Neo GFP-Progerin 载体是研究人类衰老分子机理的尖端分子生物学工具，其在体外细胞模型中的核心表现如下：The BioVector® pLenti CMV TRE3G Neo GFP-Progerin delivery design serves as a cutting-edge platform for decoding the hallmarks of human senescent cascades:

早衰蛋白的分子机制 (Mechanism of Progerin Expression)

Progerin 是核纤层蛋白 A（Lamin A / 由 LMNA 基因编码）的一种病理性剪切突变体。由于该突变丢失了 C 端的一个关键剪切位点，导致其分子末端发生永久性的法尼酰化（Farnesylation），无法从核膜上脱落，从而在核内膜上形成异常沉积。Progerin is a truncated, pathologically spliced mutant variant of Lamin A. Due to the deletion of an internal cleavage site, it undergoes permanent farnesylation at its C-terminus, trapping the structural meshwork underneath the inner nuclear membrane.

诱导表达的细胞生物学表型 (Cellular Phenotypes Upon Dox Induction)

当通过慢病毒将该载体稳定整合到人原代成纤维细胞、间充质干细胞（MSCs）或诱导多能干细胞（iPSCs）中，并添加 BioVector® Doxycycline 诱导后，细胞会集中重现以下早衰病理特征：Following stable lentiviral integration and subsequent exposure to BioVector® Doxycycline, target cells dynamically mimic Hutchinson-Gilford Progeria Syndrome (HGPS) pathology:

• 核畸形与异染色质丢失 (Nuclear Dysmorphology)：在荧光显微镜下可直接观察到 GFP-Progerin 强烈定位在核膜边缘。随着蛋白富集，原本圆润的细胞核会发生严重的核膜起皱、起泡（Blebbing）和分叶畸形，伴随异染色质标志物（如 H3K9me3）的剧烈丢失。(Direct fluorescent microscopy captures GFP-Progerin reinforcing the nuclear periphery, triggering nuclear blebbing, invaginations, and the profound loss of heterochromatin signatures.)

• DNA 损伤与细胞加速衰老 (DNA Damage and Accelerated Senescence)：Progerin 在核膜的沉积会严重干扰 DNA 复制与转录，引发内源性复制压力，导致细胞内出现大量的 gamma-H2AX 损伤灶。最终迫使细胞周期永久停滞，停止增殖，并高表达衰老相关 beta-半乳糖苷酶（SA-beta-gal），分泌大量的衰老相关表型因子（SASP）。(Accumulation blocks replication forks, inducing gamma-H2AX damage foci, permanently arresting the cell cycle, and driving strong SA-beta-gal scaling alongside SASP secretion.)

3 宿主大肠杆菌扩增与质粒维持规范 / Bacterial Amplification Protocols

警告 / Critical Warning该载体含有慢病毒的长末端重复序列（LTR），且内部带有高度重复的 7 乘以 tetO 操纵子元件，属于极度不稳定的“易突变/易重组”质粒。严禁使用普通的常规克隆菌株（如 DH5a 或 JM109）进行扩增，否则极易发生 LTR 缺失或 TRE 启动子重组片段丢失，导致质粒彻底失效。Due to conflicting lentiviral long terminal repeats (LTRs) flanking the repeating 7xtetO motifs, this plasmid is classified as highly unstable. Never amplify this backbone using conventional cloning bacteria like DH5a. Doing so risks extensive LTR rearrangement or TRE truncation, rendering the batch non-functional.

选用的宿主菌株与培养基配方 / Authorized Bacterial Host and Broth Rules

• 推荐宿主菌株 (Mandatory Host)：BioVector® Stbl3 或 BioVector® Stbl4 基因工程大肠杆菌（此类菌株缺失了 recA1 和 endA1 关键重组酶，能极大稳定重复序列质粒 / Competent lines engineered to suppress deletion tracks in unstable repeats）。

• 专用扩增培养基 (Growth Medium)：BioVector® LB Liquid Medium 液体培养基（每升含 10 g 胰蛋白胨、5 g 酵母提取物、10 g 氯化钠 / 10g Tryptone, 5g Yeast Extract, 10g NaCl per liter）。

• 抗生素浓度 (Antibiotic Selection)：添加 100 ug/mL BioVector® Ampicillin（氨苄青霉素）。

• 物理栽培控温 (Thermal Parameters - Critical)：为了进一步降低自发重组率，全程必须在 30 摄氏度下进行恒温震荡培养（180 到 200 rpm），禁止在传统的 37 摄氏度下快速生长。过夜培养时间可适度延长至 16 到 20 小时。(To minimize deletion mutations, the culture must be shaken strictly at 30 degrees Celsius (180 to 200 rpm). Do not grow at standard 37 degrees Celsius.)

4 慢病毒包装、纯化与靶细胞稳定株筛选 / Lentiviral Packaging and Transduction

A 阶段：三/四质粒系统慢病毒包装 / Phase A: Lentiviral Production

1. 将高纯度、无内毒素的 BioVector® pLenti CMV TRE3G Neo GFP-Progerin 质粒与标准的慢病毒三质粒或四质粒包装辅助系统（如含 pMD2.G 逆转录包膜质粒和 psPAX2 包装质粒）按比例混合。(Blend the endotoxin-free inducible vector with validated packaging helper vectors.)

2. 使用 BioVector® Transfection Reagent 细胞高效转染试剂，共转染处于对数生长期、状态极佳的 293T 慢病毒包装宿主细胞。(Co-transfect highly proliferative, low-passage 293T cells using targeted transfection matrices.)

3. 转染后 48 至 72 小时，小心收集富含高滴度慢病毒颗粒的细胞培养上清液。使用 0.45 um 的低蛋白结合滤膜过滤清除细胞碎片。(Harvest viral-rich supernatants at 48 to 72 hours post-transfection and pass through a 0.45 um polyethersulfone filter.)

4. 利用冷冻超速离心机（如在 4 摄氏度下以 80000 乘以 g 超速离心 2 小时）或使用 BioVector® Lentivirus Concentration Kit 慢病毒浓缩试剂盒进行沉淀浓缩，分装后立刻投入零下 80 摄氏度深冷保存，避免反复冻融导致滴度大跌。(Concentrate via ultracentrifugation or specialized precipitation chemistry, aliquot into working volumes, and flash-freeze at minus 80 degrees Celsius.)

B 阶段：靶细胞感染与 G418 稳定抗性株筛选 / Phase B: Host Infection and G418 Selection

1. 根据实验需求，将稀释后的慢病毒液加入到铺好的靶细胞（如人皮肤原代成纤维细胞）中，同时加入最终浓度为 6 至 8 ug/mL 的 BioVector® Polybrene（聚布雷烯感染增强剂），以显著提高病毒吸附穿透效率。(Apply diluted lentivirus to target cells along with 6 to 8 ug/mL BioVector® Polybrene to improve structural viral attachment waves.)

2. 感染 24 小时后，完全吸除带有病毒的废液，更换为新鲜的完全培养基。

3. 感染 48 小时后，在培养基中加入经过滴定筛选出的最优致死浓度的 BioVector® G418 / Neomycin 筛选补剂（对于常规成纤维细胞，维持浓度通常在 200 到 600 ug/mL 之间）。(Introduce selected cytotoxic tiers of BioVector® G418/Neomycin to clear non-transduced cells, typical levels for mammalian fibroblasts range between 200 and 600 ug/mL.)

4. 连续维持筛选 10 到 14 天，期间每 2 到 3 天更换一次含有 G418 的新鲜培养基，直到未感染的对照组细胞完全死亡。最终存活并发生克隆化铺展的细胞群即为稳定整合了该四环素诱导系统的多克隆稳定株。(Maintain selection dynamics for 10 to 14 days until un-infected control cells are cleared, generating the stable responsive poly-clonal pool.)

5 稳定株多西环素（Dox）诱导表达与功能质控 / Dox-Induction and Assays Workflow

功能双验证红线 / Critical Validation Milestone在未添加多西环素的维持状态下，该稳定株在荧光显微镜下必须表现为完全无绿色荧光（GFP阴性），且核形完全正常。如果在未加药时即能在显微镜下观察到部分细胞发出绿色荧光，证实细胞株存在严重的启动子漏表达或培养血清中含有微量四环素类衍生物残留，需立即更换使用 BioVector® Tet-System Approved FBS（四环素绝缘专用胎牛血清） 重新栽培筛选。In the absence of Dox, cells must show absolute absence of green fluorescence (GFP negative) with flat, elliptical nuclear envelopes. Any premature green tracking confirms high promoter leakage or tetracycline derivatives contaminating the base serum. Switch immediately to BioVector® Tet-System Approved FBS to re-establish proper control limits.

诱导启动与动力学检测流线 / Induction and Kinetic Validation Sequence

1. 将筛选得到的稳定细胞株按标准密度接种于多孔板或盖玻片上，使其正常贴壁生长。

2. 配制诱导工作液：吸取适量 BioVector® Doxycycline 储备液，用含有四环素绝缘血清的完全培养基稀释至最终工作浓度 100 到 1000 ng/mL（常用标准浓度为 500 ng/mL）。(Prepare the induction media by diluting BioVector® Doxycycline stock into feeding media to achieve a functional working tier of 100 to 1000 ng/mL.)

3. 加入细胞中，将此时间点设为 0 小时，移入孵箱开始连续时间动力学培育。

4. 荧光与形态学追踪时间节点 (Imaging Verification Windows)：

   • 诱导后 12 到 24 小时：可在倒置荧光显微镜下观察到绿色荧光自发亮起，主要集中聚集在细胞核的边缘（Nuclear rim），此时核外形尚未发生严重畸变。(Green fluorescence awakens inside the nuclear rim, outlining the nuclear boundary prior to physical distortion.)

   • 诱导后 48 到 72 小时：GFP-Progerin 表达达到峰值平台期。此时，核膜开始大面积出现经典的凹陷、折叠、起泡扭曲畸形。

5. 功能衰老表型终点确证 (Downstream Senescence Assays)：在加药诱导后的第 5 天至第 7 天，可收集细胞执行 BioVector® SA-beta-gal 细胞染色实验（衰老阳性细胞比例通常会大幅飚升至 70% 以上），或提取总蛋白进行 Western Blot 免疫印迹，利用抗 Lamin A/C 特异性抗体检测分子量约为 67 kDa 的 GFP-Progerin 融合表达条带，作为该诱导功能系统合格交付的终点依据。(By days 5-7 post-induction, sample plates can be mapped using the BioVector® SA-beta-gal Chromogenic Kit to quantify senescent fractions, or run via Western Blot with anti-Lamin A antibodies to resolve the unique 67 kDa GFP-Progerin band.)

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